摘要:猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是断奶猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的病原。其中猪圆环病毒(PCV-2)不仅是断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的病原,而且能够引起多种猪病。随着规模化养殖业的不断发展,由PCV-2引起的疫病呈上升趋势,给全世界养猪业带来了巨大的经济损失。为了探讨有效控制本病的方法,特对该病的病原学、流行病学、致病机理、诊断及防制措施的研究情况进行了综述。[O_U user_role=”Administrator,Author,Contributor,Editor,Subscriber,Customer,Shop Manager” blocked_meassage=”请登录后继续浏览“]
猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科,为单股环状DNA病毒。分为l型(Porcine circovirus typel,PCVI)和2型(Porcine circovirus type2,PCV2),其中PCV1不致病,PCV2具有致病性,能引起猪的多种病症,如断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(poreine dermatitisand nephropathy syndrome,PDNS)及繁殖障碍等。自加拿大1991年首次报道发生PMWS以来,现在全世界大多数养猪国家均有该病发生。PCV2感染能造成免疫抑制,易继发或并发其它病原体感染,对养猪业造成很大的经济损失。
1 病原学
1974年德国人Tischer在PK-15细胞系中发现了一种与细小病毒类似的颗粒,由于该颗粒不引起细胞病变,因此当时被认为是一种细胞污染物[[1]]。1982年,Tischer等人又通过对这种细胞污染物进行提纯镜检及核酸鉴定,最后确定为一种新的病毒,并命名为猪圆环病毒(PCV)[[2]]。
PCV属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus),无囊膜,病毒粒子呈二十面体对称,为直径17~20 nm的DNA病毒,是目前发现的最小的动物病毒之一。病毒基因组为共价闭合、单股负链环状DNA,基因组全长1768 bp或1767 bp,推测含有大小相差悬殊的11个开放阅读框(ORFs),其中ORF1、ORF5、ORF7和ORF10位于病毒基因组DNA链上,5’→3’方向相同(顺时针方向);ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9和ORF11位于互补链上,5’→3’方向相同(逆时针方向)。11个ORFs充分利用了病毒有限的遗传物质,彼此重叠。预测PCV2的11个ORFs可编码1.8~35.8 kD大小的蛋白质,在11个ORFs中ORF1和ORF2是两个主要的开放阅读框 [[3]]。
ORF1编码Rep蛋白,其与病毒基因组的滚环复制相关[[4]],由314 aa组成,分子量为35.8 kD。Rep蛋白具有与典型滚环复制(RCR)相关的3个保守基序列I(FTLNN)、II(HLQG)、III(YCSK)以及结合dNTPs的p环(p-loop)结构(序列为G-GKS),这些结构对于维持Rep蛋白的功能至关重要,若发生突变或缺失均会影响病毒的复制。
ORF2编码Cap蛋白,其为病毒的主要结构蛋白,分子量28~36 kD,构成病毒的核衣壳,在病毒感染细胞后宿主各种酶的参与下产生。PCV2不同分离株Cap蛋白基因变异性较大,同源性仅为65%,这说明病毒的基因型是由Cap蛋白决定的。研究表明Cap蛋白具有较好的免疫原性,能诱导机体产生较强的抗体反应。
PCV2不能在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞以及一些猪传代细胞系(PT、PET)上生长。PCV2可以在具有旺盛增殖能力的细胞上生长,因为其DNA的复制依赖细胞周期中S期表达的细胞蛋白。PK-15细胞是体外培养PCV2的良好细胞,把PCV2接种到无PCV污染的单层PK-15细胞上能够获得良好的病毒复制增殖。PCV2在所有细胞上培养时均不产生细胞病变。病毒粒子的数量在一定时间内随培养时间的延长而增加,接种18 h后可在细胞中检测到PCV2抗原,30 h可检测到游离的病毒粒子,随后病毒含量逐渐增加,一般在接毒后48 h~72 h之间收获病毒,但总体上病毒滴度较低。有研究表明接种PCV2后18 h用300 mmol/L的D-氨基葡萄糖(glucosamine)处理PK-15细胞培养物30 min,可促进病毒DNA进入细胞核,提高病毒复制能力,增加30%的细胞感染率。PCV2在PK-15细胞上延长培养24 h,同样可以获得良好增殖[[5]]。当PCV2在PK-15细胞上连续传代(120代)时,可导致少数氨基酸突变,但病毒的生长活力提高,而毒力降低。
PCV2在CsCl中的浮密度为1.37 g/cm,沉降系数为52 S,相对分子量为5.8×102 kD[[6]]。PCV2对外界的抵抗力较强,在pH为3的酸性环境中可以存活很长时间。对氯仿、碘酒、乙醇等有机溶剂不敏感,但对苯酚、季胺盐类化合物、氢氧化钠和氧化剂等较敏感[[7]],当用双氯苯双胍己烷、福尔马林、碘酒和酒精于室温下处理10 min,病毒滴度会下降。PCV2在56℃或70℃下经氯仿处理不被灭活,在高温环境(72℃)能存活15min。PCV2不具有血凝活性,不能凝集人和牛、羊、猪、鸡等多种动物的红细胞[[8]]。
2 流行病学
猪是PCV2的天然宿主。各种年龄的猪均可感染,尤其以哺乳期和育成期的猪最易感,对于5~12周龄的仔猪一般在断奶后2~3 d发病。去势后的公猪比母猪、长白猪比杜洛克或大白猪更容易发生PMWS。小鼠在经人工感染后可以产生抗体,但不出现明显的病理变化或出现轻微的显微病理变化,因此也常用作PCV2感染的试验动物模型。对于牛、绵羊、马等动物一般不感染PCV2。
猪圆环病毒病主要的传染源是病猪和带毒猪。传染途径主要是通过呼吸道(鼻腔、气管和支气管分泌物)和口腔排出病毒,其次通过尿液、粪便等排出,经过直接接触(猪-猪间的鼻头摩擦、交配等)或经消化道、呼吸道而间接传播给其他健康易感猪。PCV2能够通过妊娠母猪的胎盘垂直感染胎儿,导致死产或胎儿出生后不久死亡。PCV2也可通过感染公猪的精液排出,通过交配或人工授精传播。
对于PCV2感染猪是否出现临床症状受到体内外多种因素的综合影响,例如猪体的免疫水平、营养状态、病毒毒力、饲养管理水平、各种环境因素以及其他病原微生物混合感染等都会显著影响病猪出现临床症状。所以临床上常见有的PCV2感染猪呈亚临床的隐性感染状态,而有的则表现明显的临床症状和病理变化。另外,本病的发生没有明显的季节性,一年四季均可发生。
目前,PCVD呈世界性流行,各地猪群中PCV2的感染率都非常高。血清学调查表明,多数猪群PCV2血清阳性率为20%~50%。比利时对1985~1999年不同类型猪血清样品检测表明,PCV2阳性率达100%;在北美和欧洲猪群中,发病率占被侵袭猪群的5%~10%,死亡率达100%;德国屠宰猪血清中抗体阳性率达85%,英国随机采集的猪血清样品中血清阳性率达80%。我国在1999年开始研究PCV2,郎洪武等应用ELISA法对我国7省市不同类型猪群559份样品进行检测,总阳性率达42.9%[[9]];王忠田等通过对山东、山西等地规模化猪场的临床和PCR检测结果发现,11个猪场发生猪圆环病毒2型所致的PMWS[[10]];马增军等检测了河北省及北京、天津部分规模猪场和散养猪群共398份猪血清样品的猪圆环病毒2型抗体,结果显示被检猪场抗体阳性率为90.9%,血清样品抗体总阳性率为84.2%,其中种母猪抗体阳性率86%,种公猪抗体阳性率88.2%,育肥猪抗体阳性率85.2%,断奶仔猪抗体阳性率为76.7%[[11]]。上诉研究结果表明PCV2的感染在国际和国内的各个地区均普遍存在。
3 PCV2对机体免疫系统的影响
研究表明,PCV2可以引起免疫系统性疾病,即在一定程度上能抑制机体的免疫功能。对于PCV2致病性研究主要集中于病毒对免疫系统的影响方面,包括PCV2感染对于免疫细胞的致病作用和免疫器官组织病理学变化等方面。
用PCV2特异性抗体对PMWS的组织切片进行免疫标记,常可在淋巴组织,特别是淋巴结的单核巨噬细胞,以及脾、淋巴结生发中心的树突状细胞中发现较高的病毒抗原浓度[[12]]。PCV2抗原一般出现于细胞的细胞浆,但也可在细胞核中检测到。在试验性感染的小鼠中[[13]],PCV2核酸见于淋巴结生发中心的巨噬细胞和凋亡细胞的细胞核和细胞浆,肝细胞和肾小管上皮细胞的细胞核以及胸腺淋巴细胞的细胞浆中。用免疫胶体金标技术检测PCV2抗原,还发现主要存在于支气管和支气管粘膜上皮、炎灶中的单核细胞和多核巨细胞和明显正常组织中的单核细胞中,如小肠和支气管粘膜下层的淋巴组织[[14]]。
主要表现为特征性淋巴组织病变。PCV2常感染猪的扁桃体、淋巴结和脾脏中的滤泡间树突状细胞和淋巴细胞,多表现为使其减少或衰竭并被类上皮样巨噬细胞的组织细胞、多核巨噬细胞和嗜酸性粒细胞聚集炎性肉芽肿组织所代替等特征性病变[[15],[16]]。伴随淋巴的损伤,单核细胞核嗜碱性细胞向淋巴系统的组织细胞中发展并成为白细胞减少症,这一现象最早在7~10d即可以检测到,但并非所有感染PCV2的动物都引起PMWS,而白细胞减少症也只发生于PMWS。PMWS患猪的淋巴组织病理学变化主要表现为T淋巴细胞和B淋巴细胞的减少,巨噬细胞凋亡。Chianini等[[17]]对PMWS患猪检测表明,淋巴组织中最具实质性的变化是B和T淋巴细胞减少或缺失,巨噬细胞增多,淋巴组织中抗原提呈细胞的局部丧失和重新分布。Shibahara等[[18]]检测PCV2感染猪的淋巴组织发现,淋巴细胞和巨噬细胞的凋亡比较明显,巨噬细胞内含有多量包涵体并伴有凋亡小体,淋巴小结内出现许多呈溶菌酶阳性的巨噬细胞,B淋巴细胞数减少并发生凋亡,在巨噬细胞的凋亡小体中发现了PCV2病毒粒子。正因为引起淋巴细胞减少、缺失、组织细胞浸润等组织病理变化,使动物机体免疫功能紊乱或者下降,使猪群整体抗病能力降低,混合感染发生频率增加,由此给猪场造成严重的直接和间接经济损失[[19]]。
4 PCV2的诊断
关于PCV2的诊断主要分为临床诊断和是实验室诊断。临床诊断主要是根据疾病的流行特征、临床诊断和病理变化进行初步诊断,如需确诊还要进行进一步的实验室诊断。
实验室诊断的常规方法是对病毒进行分离与鉴定,经PCR检测确认没有PCV2污染的PK-15细胞进行分离,通常在病毒接种后3 d,用原位核酸杂交、间接荧光抗体法、Real-time FQ-PCR法或电镜观察,确认病毒的存在[[20],[21]]。原位核酸杂交方法是用克隆的PCV-PK-15的复制型(RF)DNA为探针,可检测出福尔马林固定组织病料中的病毒DNA。它可灵敏和精确的定位PCV2在组织器官及其细胞中的存在部位,常用于临床病料的检测和病理分析[[22]]。间接免疫荧光法是将处理好的组织病料接种于PK-15细胞并培养一段时间,经丙酮固定后,用PCV2高免血清与细胞培养物中的PCV2反应,可对PCV2进行检测和定型,这种方法适宜于细胞培养物中PCV2的检测[[23]]。
用Real-time FQ-PCR法可对血清/血浆及组织病料中的PCV2进行定量检测。用含有PCV2 ORF2基因的标准质粒建立标准曲线,可检测组织中病毒DNA含量。
为建立PCV2的特异性诊断方法,用试验室合成PCV2 ORF2蛋白的B-133表位为抗原,建立ELISA方法,进行PCV2感染的血清学检测,结果表明该方法特异性很高,但其灵敏性不太高,因此不适用于血清学检测。应用表达蛋白为抗原建立ELISA方法,其抗原制备较简单,产量高,灵敏性和特异性都很好,因此更适用于临床检测及大规模血清学调查[[24]]。
5 PCV2的防治进展
根据目前世界各国防治本病的经验表明,对共同感染的不同病原进行适当的主动免疫和被动免疫,对于本病预防和治疗有明显的效果;而且有针对性投药和治疗,对于控制细菌性的混合感染或继发感染,也同样有效。目前,由于对于PCV2引起的相关疾病的病原和致病机制尚不清楚,因此,我们并不能完全依靠特异性防制措施,只有同时结合良好的饲养管理和适当的免疫程序,才能够更好的防控该疾病的发生[[25]]。
良好的饲养管理对于本病的防制至关重要,所以应主要应注意以下几个主要问题:首先是对病猪的隔离饲养,严重感染猪可进行扑杀、焚烧等,以切断传染源。其次,要减少猪的应激,过早的断奶或者是断奶后过早更换饲料和断奶后并窝合群都易造成猪的应激。因此对于发病猪场,仔猪断奶的日龄可延迟至28 d或35 d,断奶后继续饲喂断奶前的饲料至少10 d;对于断奶后的仔猪应采用小群原窝原群隔离饲养,减少窝与窝之间的水平传播;过早或多次的疫苗注射也可引起免疫刺激及猪的免疫应激,从而促使仔猪产生临床症状,因而必须按照猪场或周边的疫病情况合理制定免疫程序,避免过早或多次对仔猪进行免疫;从而可以减少应激对猪所产生的影响。此外,降低饲养密度,注意通风和保暖,可减少疾病的发生。最后,要强化猪场的生物安全。猪场的生物安全不但要使用于猪场与外界之间,而且还要使用于猪场内部,即猪舍与猪舍之间。在猪场与外界之间,应减少后备母猪的购入数量。此外,断奶猪舍在进猪前必须严格清洗消毒,同时执行全进全出的饲养制度。在每个猪舍的入口处必须设计消毒池,饲养人员在进入前必须消毒。
PCV2的免疫预防研究较缓慢,由于PCV2感染可以导致淋巴系统的损伤,并引起机体的免疫抑制,而且PCV2单独感染一般不引起动物发病,但感染PCV2后,如果再受到疫苗接种、免疫佐剂等免疫刺激,便会引发典型的PMWS。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)可以促进PCV2的复制,临床上出现的PMWS病例中,大多数有PRRSV、PPV或者其它病原的存在。我们对导致PCV2活化和发病的免疫调节机制还不完全清楚,临床上PCV2存在广泛的隐性感染。因此目前对PCV2的防治并没有完全有效的药物或疫苗。
近年来,PCV2 全病毒灭活疫苗、 PCV1PCV2 嵌合病毒灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗等在一些国家已开始用于 PCVAD 的预防[[26],[27],[28]]。通过免疫接种可以提高仔猪的成活率或降低因 PCV2 感染所造成的生产性能低下,但是疫苗的免疫保护效果仍然不够理想[[29]]。因此,研究预防和治疗 PCVAD 的新方法、新制剂具有重要的理论和实践意义。
法国学者Blanchard[[30]]报道,利用PCV2 ORF2基因研制PCV2 DNA疫苗、基因工程疫苗与表达粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的真核表达质粒联合免疫猪群,结果显示免疫后的猪群可抵抗PCV2的攻击。Kamstrup[[31]]等用ORF2基因的核酸疫苗免疫小白鼠,在首免后62 d小白鼠体内可检测到高水平的体液抗体。美国学者Fcnaux[[32]]以PCV1为骨架构建了嵌合病毒PCVl-2,也可以诱导机体产生具有保护性抗体。但上述两种疫苗的评价均是在试验猪单独应对PCV感染时进行的。该疫苗是否能在协同因子(如PRRSV,PPV等)共感染时发挥作用还不得而知。最近Fenaux[[33]]又报道将PCV2在PK-15细胞上连续传代120代,结果发现有两个碱基发生了突变,并导致了两个氨基酸的变异,变异后的PCV2在细胞上和猪体上的增殖滴度增加了,但对猪的毒力明显下降。这一发现为研制PCV2弱毒疫苗开启了新思路。
(作者:李曼,邹赐玺,梁小军)[/O_U]
原创文章,作者:郭 遠,如若转载,请注明出处:http://zgdwbj.com/archives/31196